EGFR酪氨酸激酶抑制剂在携带BRAF 3类突变的非小细胞肺癌中的临床和临床前活性

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EGFR酪氨酸激酶抑制剂在携带BRAF 3类突变的非小细胞肺癌中的临床和临床前活性

携带BRAF 3类突变的肿瘤患者缺乏靶向治疗，本研究对两名携带BRAF 3类突变的转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者在标准治疗失败后接受了厄洛替尼治疗并观察疗效。本研究建立了两个源自BRAF 3类突变NSCLC患者的细胞系，并以EGFR突变、BRAF 1类和2类突变以及KRAS突变的NSCLC细胞系作为对照，评估了它们对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）的敏感性。患者1，一名60岁男性，患有BRAFD594ND594N突变的NSCLC，在一线和二线化疗进展后，对厄洛替尼达到完全缓解。患者2，一名60岁女性，患有BRAFG466VG466V突变的NSCLC，在一线化疗进展后，对厄洛替尼达到部分缓解。厄洛替尼抑制了BRAF 3类突变细胞系（IC50 6.33IC50 6.33 和 7.11 μM7.11μM）和BRAF 2类突变细胞系（IC50 5.51 μMIC50 5.51μM）的二维生长，尽管所需浓度高于EGFR突变细胞系，而对BRAF 1类突变（IC50,>25 μMIC50,>25μM）或KRAS突变（IC50,>25 μMIC50,>25μM）细胞系则无效果，提示对于BRAF 3类突变的NSCLC可能提供较为有效的治疗策略。

BRAF改变发生在大约2%-5%的非鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）中，BRAF和MEK抑制剂对于携带BRAF非V600非V600改变（特别是3类突变）的患者，尚无靶向疗法显示出令人信服的临床活性。 在携带BRAF 3类突变的NSCLC中，已观察到EGFR等受体酪氨酸激酶对RAS的激活，表明突变型BRAF放大了EGFR触发的RAS信号传导。尽管三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）已被证明对携带EGFR突变的NSCLC患者有效，但其针对BRAF 3类突变的潜力仍未得到探索。本研究旨在为EGFR-TKIs用于BRAF 3类突变NSCLC患者提供理论依据和初步证据。

材料与方法

01

患者识别

本研究纳入了在本院接受EGFR-TKIs治疗、经下一代测序（NGS） 检测出携带BRAF 3类突变且无其他并发驱动基因改变的晚期或转移性NSCLC患者，识别出两名在标准治疗失败后接受厄洛替尼150 mg每日一次治疗的患者。

02

细胞系和患者来源异种移植模型的建立

从两名接受厄洛替尼治疗的BRAF 3类突变NSCLC患者中的一位（携带BRAFD594ND594N突变）的淋巴结转移灶建立了一个患者来源异种移植模型（PDX），通过将肿瘤活检片段植入BALB/c Rag2−/−−/−; Il2rg−/−−/− (BRG) 免疫缺陷小鼠中完成。同时，从一名IV期NSCLC患者（携带BRAFG466VG466V 3类突变）在一线帕博利珠单抗治疗进展时的淋巴结转移活检中建立了第二个细胞系（ADK–14），并从一名携带KRASG12VG12V突变的未经治疗的NSCLC患者建立了第三个细胞系作为对照（ADK–17）。此外，使用了两个EGFR突变（PC–9和HCC–827，均带有E746_A750del突变）的预先建立的NSCLC细胞系、一个BRAF 1类突变预先建立的NSCLC细胞系（HCC–364，带有V600E突变）和一个BRAF 2类突变NSCLC预先建立的细胞系（NCI–H1395，带有G469A突变）作为对照。

03

球体形成实验

将细胞以10,000个细胞（NCI–H1395为5,000个细胞）接种在6孔超低吸附板（Corning Life Sciences, Corning, NY）的4 mL无血清完全MammoCult培养基中。将药物和载体以不同剂量添加到培养基中。细胞在37°C、湿润的5% CO₂气氛中培养一周。大约在接种后7天计数球体（直径大于90 μm的多细胞结构）。

04

临床数据及数据分析

通过将细胞暴露于处理6小时来评估药物的效果。使用抗EGFR单克隆抗体、抗磷酸化-EGFR (Tyr1068) 单克隆抗体、抗ERK1/2单克隆抗体和抗磷酸化-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) 单克隆抗体作为一抗。使用小鼠抗肌动蛋白单克隆抗体或抗 vinculin 抗体检测参考蛋白。将膜与多克隆辣根过氧化物酶偶联的抗兔和抗鼠免疫球蛋白G抗体一起孵育。

结果

患者1，60岁男性，既往吸烟史，于2010年因淋巴结和脑转移被诊断为IVB期肺腺癌。接受一线化疗（卡铂+吉西他滨）四个周期，并对单一脑转移灶进行了有效的立体定向放射治疗。在化疗开始后首次影像学肿瘤再评估出现胸内淋巴结进展性疾病（PD）后，接受了二线多西他赛10周期治疗（75 mg/m22，每3周一次），获得疾病稳定作为最佳反应。随后在纵隔淋巴结发现疾病进展，遂于2011年7月开始三线厄洛替尼150 mg每日一次治疗，达到完全缓解（图1）。

病例2

患者2，60岁女性，重度吸烟者，2021年因胸膜、骨和淋巴结转移被诊断为IVB期肺腺癌（图2）。NGS显示BRAFG466VG466V 3类突变。PD-L1肿瘤比例评分为0%。在接受一线化疗免疫治疗（卡铂+培美曲塞+帕博利珠单抗）三个周期后，出现临床和影像学PD证据。鉴于存在原发性治疗耐药的证据，开始了二线厄洛替尼150 mg每日一次治疗。治疗1个月后，计算机断层扫描显示客观部分缓解，可测量肿瘤病灶减少40%或更多（图2）。但患者在肿瘤再评估后去世，可能死于急性心血管事件，尽管无法证实确切死因。

为了证实临床观察并探索其背后的科学原理，研究团队开展了系统的临床前研究并成功建立了两个源自BRAF 3类突变NSCLC患者的细胞系：PDX-ADK-36（BRAF D594N，源自患者2的PDX模型）和ADK-14（BRAF G466V）。同时，他们选取了多株对照细胞系，包括：EGFR敏感突变系（HCC-827, PC-9：均含19外显子缺失）；BRAF V600E突变系（HCC-364：1类突变）；BRAF G469A突变系（NCI-H1395：2类突变）；KRAS G12V突变系（ADK-17）。研究团队提出假设：在BRAF 3类突变肿瘤中，可能存在野生型EGFR的过度活化，而突变型BRAF扮演了“信号放大器”的角色。蛋白质印迹（Western Blot）分析完美验证了这一假设：在两个BRAF 3类突变细胞系（PDX-ADK-36, ADK-14）和两个EGFR突变细胞系中，均检测到高水平的基底磷酸化EGFR（pEGFR）。而在BRAF 1类、2类及KRAS突变细胞系中，pEGFR水平很低。使用厄洛替尼处理后，能显著降低BRAF 3类突变和EGFR突变细胞系中的pEGFR/EGFR比值，但对其他细胞系无此效果。值得注意的是，厄洛替尼并未抑制BRAF 3类突变细胞中ERK的磷酸化，说明其抗癌效应并非通过直接抑制MAPK通路下游实现，而是作用于上游的EGFR（图3）

 

细胞系基线EGFR活化及对厄洛替尼的比较敏感性。(A) 蛋白质印迹显示接种30小时后的基线EGFR活化情况。(B) 厄洛替尼给药对EGFR磷酸化的影响，以pEGFR/EGFR比值衡量（n = 2-4次重复）。(C) 逐渐增加剂量的厄洛替尼（n = 2-5次实验，每次三个重复）对细胞二维（2D）生长的影响。(D) 逐渐增加剂量的厄洛替尼（n = 2-4次重复）对软琼脂中三维（3D）细胞生长的影响。(E) 逐渐增加剂量的厄洛替尼（n = 2-4次重复）对球体形成能力的影响。

   为了增强结论的普适性，研究者检索了癌症细胞系百科全书（CCLE）数据库。分析发现，与BRAF 2类突变和KRAS突变细胞系相比，BRAF 3类突变细胞系对吉非替尼和阿法替尼的敏感性显著更高（中位IC50值更低），其敏感程度与EGFR突变细胞系相似。而对于MEK抑制剂、BRAF抑制剂等多靶点药物，不同基因分型的细胞系间则无显著敏感性差异。这一独立数据有力地支持了本研究的核心结论（图4）。

 

BRAF 2类突变和KRAS突变细胞系观察到的中位IC50，与EGFR突变细胞系显示的IC50相当

在不同细胞系之间未观察到对其他药物敏感性的差异。

讨论

这是首篇报道EGFR-TKI（厄洛替尼）在BRAF 3类突变NSCLC患者中产生显著且持久临床疗效的研究，打破了该类突变“不可靶向”的传统认知。该研究提出了一个合理的作用机制模型——BRAF 3类突变肿瘤依赖于由野生型EGFR激活所触发的RAS信号，而突变BRAF将其放大。抑制上游的EGFR即可切断这条致癌信号的源头。研究提示，BRAF 3类突变可作为预测EGFR-TKI疗效的新型生物标志物，为这部分罕见突变患者定义了一个新的、可从中受益的分子亚群。

对于标准治疗失败、且检测出BRAF 3类突变的晚期NSCLC患者，本研究为尝试使用厄洛替尼等EGFR-TKIs提供了强有力的理论和实践依据。特别是在没有其他更好治疗选择的情况下，这无疑是一个充满希望的选择。本研究模式为发现其他罕见突变的靶向治疗策略提供了范例。同时，未来研究可进一步探索EGFR-TKI与MEK抑制剂等药物联用是否能为这类患者带来更大获益。

结论

本研究确立了BRAF 3类突变是NSCLC中对EGFR-TKIs敏感的新型预测性生物标志物。这为目前缺乏靶向治疗选择的BRAF 3类突变NSCLC患者开辟了一条全新的、基于已上市药物的治疗路径，具有立即改变临床实践的潜力。

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